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abi,3730

2017-05-03 10:17:59 知识文库 来源:http://www.dazhihui008.cn 浏览:

abi,3730 ABI3730xl型测序仪日常维护标准操作规程(SOP)北京BUNNY工作组ABI3730xl型测序仪日常维护标准操作规程(SOP)每天每星期每月每年需要时3730测序3730测序仪操作流程打开电脑,打开机器,待建立连接后,双击桌面图标“DC”。 待“Service Console”四个指示灯,全部本文是大智慧教育网(www.dazhihui008.cn)知识文库频道为大家整理的《abi,3730》,供大家学习参考

abi,3730

ABI3730xl型测序仪日常维护标准操作规程(SOP)
篇一:abi,3730测序仪

北京BUNNY工作组

ABI3730xl型测序仪日常维护标准操作规程(SOP)

每天

每星期

每月

每年

需要时

3730测序
篇二:abi,3730测序仪

3730测序仪操作流程

打开电脑,打开机器,待建立连接后,双击桌面图标“DC”。 待“Service Console”四个指示灯,全部变红后,自动显示操作窗口。

1预备阶段

换胶、换Runing buffer、Water。

胶从四度冰箱中取出,添加至原来的胶瓶中。少量多次,避免浪费。

Buffer 一般三天换一次,最长一周一次。主要是阳极杯 和buffer槽(阴极)。 Water、Waste槽中均换新鲜纯净水。 关闭舱门。

2 样品准备

按照BigDye? Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit说明书。

3 操作 Module mangager

点击进入后,根据毛细管长度,胶的类型及应用适当填写,如“3730_Seq_36cm_Pop7”。 Type选择 regular,Template选择StdSeq36_Pop7,也可略有改动。点击OK,保存。

Protocal manager

点击进入,Instrument protocal点击的New,键入Name,命名规则如上一步所示。 Run moduler选择在Module manager 所建立的 Type选择Regular dye set选择bigdye3.1, 点击OK

在analysis Protocal中点击New,键入名字,其他保持默认值,也可根据需要略微改动。 点击Plate manger>new>出现一个对话框,Application选择sequence analysis,Plate type 选择96孔板,Sealing 选择speta,其他根据实际情况填写,点击OK进入下一步。

键入Sample名字,选择Results group 地址 ,Instrument protocal,analysis Protocal均选择在上一步中建立的。选中RG 、IP、AP在Edit中选择Fill down?(96/48)点击OK 。 在Run schduler选中刚刚建立的Plate。

Search all通过Search 或者Find all进行寻找,找到后,选中,单击Add。 此时所编写的板子会出现在Input Stack中,选中点击菜单栏中的绿色箭头。

数据分析:在result group中寻找结果,并用sequence analysis软件进行分析。

关机:关掉软件窗口,待service console中四个指示灯全部变红后,关掉控制台。整个过程中控制台,一直开着,不要关闭。 关闭机器及电脑的电源。

3730DNA分析系统的技术特点: ?

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? 双光束双侧激光激发,后置超薄CCD 全自动上样系统 内置条形码阅读器 自动碱基识别与质量评分软件 最新推出POP-7液体分离胶 良好的温控装置提供了更大的温控范围(18~70℃)

3730DNA分析系统用于DNA测序的主要优点:

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? 电泳温度可达70℃,有助于去除二级结构的影响 良好温控装置保证片段分析准确性及重现性好 新的液体分离胶(POP~7TM Polymer)使通常读序长度即可达800bp

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? 新型碱基识别与质量评分软件,提高测序准确性 毛细管内荧光检测,灵敏度高 双光束双侧激光激发,荧光信号强度高度均一 高灵敏度提高了测序模板DNA的浓度范围 ABI 3730XL 测序仪为满足测序用户对大规模测序节省时间、降低成本和操作复杂性的要求,

Applied Biosystems 推出新的3730XL 系列DNA分析仪。3730xl 采用最新的光路系统设计,结合更优化的试剂组合和全自动化操作流程,在提高产率、提高数据质量的同时最大限度的降低试剂的消耗。应用3730 测序平台分离胶的用量可以节省30倍,反应缓冲液节省200倍,荧光染料只需要原来浓度的一半,3730xl由于致力于改进影响测序质量的最关键因素,所以能够提供给您更快更准测序成本更低的操作平台。

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? ABI全自动DNA测序仪(遗传分析仪)的详细介绍 3730xl的主要特点: - 双光束双侧激光激发,光栅分光装置和后置超薄CCD检测成像系统 - 内置一体化自动进样器及样品孔打孔装置

- 内置样品板条形码自动识别

- 100次(9600个样品)运行试剂一次上机

- 自动碱基识别与质量评分判定

- 最新推出POP-7液体分离胶,动态内镀毛细管壁

- 电泳温度范围18-70C

3730xl 主要好处

- 高质量测序结果

? 电泳温度70C,去除二级结构的影响

? 新型分离胶,可测1100碱基测序长度。

? 新型碱基识别与质量评分软件,提高测序准确性

- 最高灵敏度的光路系统

? 毛细管内荧光检测abi,3730测序仪。

? 后置超薄CCD检测系统

? 双光束双侧激光激发,荧光信号强度高度均一abi,3730测序仪。

? 高灵敏度提高检测DNA的浓度范围

- 超低成本测序平台

? 高灵敏度减少DNA和测序试剂的使用量。

? 胶使用量比3700少30倍

? 高成功率及长读结果减少非电泳相关的整体项目成本abi,3730测序仪。

? 更高的自动化减少劳力成本及人为失误的成本

高通量减少仪器折旧,人力及维护的平均成本

3730xl产率分析

测序模式毛细管电泳时间读序长度每天产率

短片段测序36 cm36min500bp1,728,000 bp

快速测序36 cm60min700 bp1,440,000 bp

标准测序36 cm90min800 bp1,113,000 bp

长片段测序50 cm120min1100 bp1,002,000 bp

规格指标:

激光:氩离子激光光源,激发波长为488nm和514.5nm

电泳电压:高达20kV

运行温度:18℃到70℃

计算机要求

硬件: PentiumⅣ处理器

操作系统:Windows ?2000

内存: 1GB

硬盘: 72GB硬盘

显示器:17寸彩色显示器

运行环境

室温:18-30℃

湿度:20%-80%

主电源

电压:200-220伏或230-240伏+/-10% 50/60HZ +/-10%|

电流:最大15安培

最大电源功率:2000瓦

仪器尺寸

宽度:100cm

深度:73cm

高度:89cm

重量:180kg

双脱氧链终止法原理

双脱氧链终止法又称为Sanger法,其原理是DNA模板在DNA聚合酶、引物、四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)存在下进行复制时,在四管反应体系中分别按一定的比例引入四种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团,当ddNTP掺入链的末端时,该链就会停止延伸。如此每管反应体系中就产生了一系列长度不等的以ddNTP为3’端的DNA片段。反应终止后,分4个泳道进行凝胶电泳以分离长短不一的DNA片段,相邻的片段长度相差一个碱基。经放射自显影后,根据片段3’端的双脱氧核苷酸,便可获得合成片段的碱基排列顺序。

ABI3730XL测序仪技术原理

ABI3730XL自动测序仪是基于毛细管电泳和荧光标记技术的DNA测序仪。3730XL测序仪拥有96道毛细管,并用荧光标记代替了Sanger法中的同位素标记,从而大大提高了DNA测序的速度和准确性。4种双脱氧核苷酸(ddNTP)的碱基分别用不同的荧光进行标记,在通过毛细管时,不同长度的DNA片段上的4种荧光基团被激光激发,发出不同颜色的荧光,被CCD检测系统识别,并直接翻译成DNA序列。

测序仪比较
篇三:abi,3730测序仪

abi,3730测序仪。

一代至四代测序技术详细讲解
篇四:abi,3730测序仪

一、我们将如何应对海量的基因信息

新一代测序技术带给人们大量遗传信息的同时,却成为限制其广泛应用的一个障碍。

1980年,英国生物化学家Frederick Sanger与美国生物化学家Walter Gilbert建立了DNA测序技术并获得诺贝尔化学奖,至今已有近三十年了。在这三十年,DNA测序技术取得了令人瞩目的进展。目前已进入市场的循环阵 列测序平台采用的是与Sanger生物化学测序方法完全不同的原理。在过去几年,应用极为广泛的毛细管电泳测序法采用的则是多线并行阵列格式,它运用尖端 的荧光成像技术进行碱基识别。上述各类新技术为生物学研究领域开辟了新的视角,也使实验研究达到一个新的水平。学界对开发这类新技术的兴趣持续高涨,与此 同时,人们却发现这些技术存在一定的不足——大量信息数据的产生限制了技术更加广泛的应用,并降低了其市场价值。

过去,研究人员使用Applied Biosystems(ABI)公司的3730XL毛细管电泳测序仪进行基因分析,每年至多能完成六千万碱基的测序量。随着测序技术日新月异的发展,这种 情况已经成为历史。在2005年刚刚开始进行新一代测序技术开发时,Roche公司和454公司联合开发的焦磷酸测序仪的分析速度就已经达到了上述提及的 ABI仪器速度的50倍之上。也就是从那时起,因基因数据过多而产生的问题凸显了出来,而且这个问题随着其他制造商开发出更多更快的测序仪而愈加严重。举 个例子,ABI的新一代测序平台SOLiD(supported oligonucleotide ligation and detection)单次运行,便可以分析6Gb的碱基序列;而Roche/454测序仪单次运行可以将上述结果转换成12-15个千兆字节 (gigabytes)的数据信息;Illumina Genome Analyzer(GAII)测序系统仅在两个小时的运行时间里,就得到10兆兆字节(terabytes)的信息。尽管对于像Applied Biosystems这样的制造商而言,可以为用户提供高达11.25TB的存储量,但对于多数实验室所具有的信息管理系统来说,规模如此庞大的数据信 息,就好像是迎面而来的洪水,让人感到难以控制。 过量信息所带来的一个副作用在于,用户无法将初始图像数据进行分类存档,而必须交给相关公司,利用软件对数据进行读取,然后才能对数据进行保存。对 于大多数研究人员来说,像这样在每次实验后对原始数据进行处理的方式既繁琐又不经济。与花费上万美元对每一段序列进行备份分析相比,对每一次测序结果进行 重新测定显然是一个更简单、更便宜的选择。测序仪制造商称,对原始数据再次进行分析并不能得到更多新的信息。但是,对于454测序仪而言,用户至少可以通 过更新的软件从原始数据得到质量更高的序列,从而提高碱基识别分辨率,减少误差。

除数据处理问题之外,研究人员还需要拥有一个足够强大的计算机平台,以便将来自多个测序技术的短小基因片段进行组合,形成基因组外显子。目前问题在 于,测序仪生产商仅仅提供用于某些特定基因信息分析的软件,如靶标重测序、基因表达分析、染色质免疫沉淀反应或基因组从头测序等,而并未提供任何其它类型 的下游生物学信息分析软件。研究界越来越熟悉这些测序平台对循证生物学的巨大潜力,这也就产生了新的研究问题以及全新类型的试验方法,而这单凭依赖目前的 生物学信息是无法满足的。

从这个角度看,SOLiD软件研发公司(公司,这一举动无疑朝正确的方向迈进了一步。该公司在开放源码许可证下开发软件分析工具,目的就是为了给生物信息学领域提供支持,并为其开发新的算法。

对用户而言,如果能够将数据格式与不同测序平台获得的结果进行比较所得的统计数字进行标准化,无疑具有重大的意义。特别是由于目前以测序平台为核心的市场竞争激烈,因此每个生产商都努力提供最好的数据结果。

在这样的大环境下,对数据及不同产品的比较结果进行标准化,便显得尤为重要。有一个方法可以更好地对不同的新一代测序技术进行比较,那就是建立一个 微阵列定性分析小组(Microarray Quality Control consortium),不仅可以对不同的技术结果进行比较,而且还可以将新技术结果与DNA微阵列或定量PCR进行比较。

综合以上各类因素,可以预见的是,新一代测序平台在近几年内,仍然会局限于少数实验室及研究者,而大多数缺少能够对基因信息进行进一步分析的实验室 则无法从新测序技术中获益。对大多数实验室而言,即使新一代的测序平台能够提供更多的信息,DNA微阵列分析仍然是一个相对便宜的选择。例如,在转录分析 中,虽然新一代测序结果不仅能给出具有很大动态范围的基因丰度信息,同时还可提供剪切变异信息以及SNP数据,但是这些数据结果都需要进行不同的DNA微 阵列分析才能获得。

那么,有没有什么方法可以解决这些问题呢?首先,相关的资金授予机构应该对生物信息学的发展予以与测序技术同等的关注;此外,由于生物信息学发展中 的瓶颈已经限制了测序机器的销售,测序仪生产商也应该联合起来解决这一难题。同时,制造商应该致力于制定以研究领域为基础而不是以不同公司为基础的生物信 息学解决方案。

因此,如果新一代测序平台真的能够带动基因组测序“普及化”——让基因组测序从大型测序中心走入每个研究人员的实验室或者小型研究小组,那么还需要 研究人员付出更多努力,开发出经济实惠的分析软件以及数据管理系统。目前的状况是,与新一代测序技术相关的生物信息学分析工作仅仅掌握在少数人手里,但是 这一具有重要价值的技术毫无疑问应该由大多数人掌握。如果数据处理问题不能得到有效解决,那么ABI公司的SOLiD系统、454公司的超高通量基因组测 序系统——GS FLX、Illumina公司的GAII系统等新一代测序仪就永远无法真正出现在能够展现其价值的舞台上。

原文检索:Editorial. (2008) Prepare for the deluge. Nature Biotechnology, 26(10): 1099.

二、传统的DNA测序技术——Sanger测序法

自上世纪90年代初,所有的DNA测序操作几乎无一例外地全部采用半自动化毛细管电泳Sanger测序法。而后来出现的高通量测序方法则首先采用以下两种方法中的一种对DNA进行预处理。

无论采用以上哪种方法处理后,我们均可以得到大量的待测序模板片段——质粒或PCR产物。随后,测序仪会进行“循环测序”反应。在每一轮测序反应的 引物延伸步骤中,会随机引入已被四种不同颜色荧光分别标记的ddNTP(ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP)以终止延伸反应。这样就形成了 大量末端被荧光标记的、长短不一(终止位点不同)的延伸产物。接着,再用高分辨率的毛细管凝胶电泳分离这些延伸产物,通过对延伸产物末端四种不同荧光颜色 的区分,计算机软件会自动“读出”DNA序列。不过,该方法在“读取”每一个碱基信息时都有可能出错。后续操作中,比如基因组组装或者找出变异位点等就是 具体情况具体解决了。一般,这种高通量测序仪一次最多只能同时进行96个或384个样品测序。

Sanger DNA测序技术经过了30年的不断发展与完善,现在已经可以对长达1,000bp的DNA片段进行测序了,而且对每一个碱基的读取准确率高达 99.999%。在高通量基因组鸟枪法测序操作当中,使用Sanger测序法的费用大约为0.5美元/1,000个碱基。

原文检索:Jay Shendure & Hanlee Ji. (2008) Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology, 26(10):1135-1145.

三、新一代DNA测序技术

DNA测序技术已广泛应用于生物学研究的各个领域,很多生物学问题都可以借助高通量DNA测序技术予以解决。过去三年,大规模平行 测序平台(massively parallel DNA sequencing platform)已经发展为主流的测序技术,这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一,还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心 的“特权”能够被众多研究人员分享。目前,新的测序技术及手段还在不断涌现,比如最新的进展就包括建立序列数据库、建立序列数据分析新方法以及设计测序试 验等等。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格,更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。今后,各种测序将成为一 项广泛使用的常规实验手段,这有望给生物学和生物医学研究领域带来革命性的变革。

DNA测序技术经历了漫长而曲折的发展历程。迄今为止,我们获得的绝大部分DNA序列都是基于Sanger测序法获得的。在过去5年间,人们至少从以下四个方面刺激了DNA测序技术的发展。

1. 具有代表性的新一代DNA测序仪

最近市面上出现了很多新一代测序仪产品,例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪、Dover/Harvard公司的Polonator测序仪以及美国Helicos公司的 HeliScope单分子测序仪。所有这些新型测序仪都使用了一种新的测序策略——循环芯片测序法(cyclic-array sequencing),也可将其称为“新一代测序技术或者第二代测序技术”。

所谓循环芯片测序法,简言之就是对布满DNA样品的芯片重复进行基于DNA的聚合酶反应(模板变性、引物退火杂交及延伸)以及荧光序列读取反应。 2005年,有两篇论文曾对这种方法做出过详细介绍。与传统测序法相比,循环芯片测序法具有操作更简易、费用更低廉的优势,于是很快就获得了广泛的应用。

虽然这些新

一代测序仪以及芯片的实际制作过程似乎都和传统的测序方法有很大的不同,而且各有特点(表3),但实际上它们背后的原理和技术都是非常相 似甚至是相同的(图1b)。新一代测序法首先也是将基因组DNA随机切割成小片段DNA分子,然后在体外给这些小片段分子的末端连接上接头制成文库,也可 以使用配对标签(mate-paired tag)制成跨步文库(jumping libraries)。随后可以通过原位polony(in situ polony,小词典1)、微乳液PCR(emulsion PCR)或桥式PCR(bridge PCR)(图5)等方法获得测序模板。

上述方法有

一个共同点,那就是任何一个小片段DNA分子的PCR扩增产物都是在空间上聚集的:原位polony法和桥式PCR法中所有的产物都集中 在平板的某处,在微乳液PCR法(emulsion PCR)中所有的产物都集中在微珠的表面。真正的测序反应本身和传统测序法一样,是由重复的聚合酶促反应和最后的荧光读取分析反应组成(图6)。本文讨论 的所有测序仪都是使用合成测序法(sequencing by synthesis),即通过聚合酶或连接酶不断地延伸引物获得模板序列,最后对每一轮反应的结果进行荧光图像采集、分析,获得序列结果。

1.1 454测序仪

454测序仪的出现极大促进了测序业务的开展,科研人员已经将测序技术作为解决科研工作中许多常见问题的利器。这是因为454测序仪在以下几个方面 取得了质的突破:首先是解决了高通量测序问题;其次它简化了样品准备步骤,将以往转化大肠杆菌扩增质粒的繁琐过程全部用简单的体外PCR扩增法替代了;最 后,它缩小了测序反应体积,节省了试剂。这样,454测序仪做到了以极其低廉的价格进行大规模平行测序反应。它的测序规模之大、测序费用之低是以往的测序 仪无法匹敌的。454测序仪与其它的新一代测序仪一起,降低了测序检测的费用,推动了测序技术平民化进程,使得小实验室也能开展测序检测项目,打破了以往 只有少数几个大型测序中心才能进行测序研究的“垄断地位”。在过去的18个月里,由于有了454测序仪的帮助,人们对人类基因组的结构有了更深入的了解, 同时第一次使用非Sanger测序法对个人进行了测序,还建立了一种发现小RNA的新方法。不过,要能让更多的人使用上新一代的测序产品,它们还需要变得 更便宜,并且更加容易操作。在一段时间之内,454测序仪必定会进一步降低测序费用,帮助人们迎接个人基因组时代的到来。

自从诺贝尔奖得主Frederick Sanger和Walter Gilbert(图2)分别发明了链终止法DNA测序技术(sequencing by chain termination technique)和链断裂法DNA测序技术(sequencing by chain fragmentation technique)之后,人们就一直希望能够扩大DNA测序技术的处理规模。到了今天,我们对测序技术的需求和对计算机技术的需求一起出现了迅猛的增 长,因为测序技术的发展速度已经远远跟不上实验要求的增长速度。于是出现了好几种替代Sanger测序法的新型测序方法,比如杂交测序法、借助原子力显微 镜(atomic force microscopy)直接DNA成像测序法(direct imaging of DNA sequence)、质谱分析法、合成测序法以及微液流测序法等等。在我们进行人类基因组计划时还出现了三项技术改进方法,即使用荧光标记物取代了放射性 标记物来标记终止碱基(双脱氧碱基);使用毛细管电泳(capillary electrophoresis)取代了传统的平板凝胶电泳;建立了末端配对测序法(paired-end sequencing)来对质粒、fosmid、人工细菌染色体(BAC)等短片段序列进行测序,解决了测序长度带来的限制问题。同时,开展研究的自动化 液体分装技术

(liquid-handling robotics)帮助我们摆脱了人工试管操作,可以用自动化的方式在微量滴定板(microtiter plate)上装载待测序样品(质粒等),极大地降低了测序的费用和劳动强度。

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